Orthosteric and allosteric action of the C5a receptor antagonists
Liu, Kim, Deepak, … Zhang — Nat. Struct. Mol. Biol. 25, 472–481 (June 2018) | DOI: 10.1038/s41594-018-0067-z
🎯 ヒトC5aR×拮抗薬の2結晶構造（PDB 6C1Q/6C1R）で、PMX53のオルソステリック作用と非ペプチド薬のアロステリック作用を初めて分子レベルで解明
① 背景と課題

炎症性GPCRであるC5a受容体（C5aR/CD88）は敗血症・喘息・関節炎・神経障害性疼痛・アルツハイマー病・がんなど多くの疾患の創薬標的だが、有望な拮抗薬の開発は難航してきた。非ペプチド拮抗薬の多くは可逆的・競合的作用しか示さず臨床効果が限定的で、後期臨床に到達したのはavacopan（CCX168）のみ。

分子レベルでの作用機序が未解明で合理的設計が困難だった
先行の熱安定化C5aR構造（11変異）は生理的妥当性に疑問。オルソステリック拮抗薬の構造基盤も未知

→ 追加変異なしのC5aR-BRILで2つの三元複合体を結晶化し、構造+ドッキング+HDX-MS+機能アッセイで作用機序を解明

② 構造・手法概要
C5aR-BRIL（N末1–29→BRIL置換）
↓
三元複合体結晶化
↓
PDB 6C1Q PMX53+NDT9513727 (2.9 Å)
PDB 6C1R PMX53+avacopan (2.2 Å)
↓
DOCK 3.6でW54011/CP-447697をドッキング
+ HDX-MS + Ca²⁺放出アッセイ
2部位作用
PMX53=オルソステリック / 非ペプチド薬=アロステリック

PMX53は7本のTMヘリックス全てとECL2に接触。非ペプチド薬はTM3/4/5表面のアロステリック部位に結合。

③ 計算化学パイプライン連携
  • lib/docking: アロステリック表面ポケットへのドッキング+W213(5.49)H結合フィルター（DOCK3.6流リスコア）
  • lib/docking: ProLIFCalculatorでshape相補性・深部残基接触をpotency推定特徴に
  • lib/molgen: C221(5.57)共有結合warhead設計のフィルター/制約条件
  • lib/md: HDX-MS由来のTM7/helix8ダイナミクスをMD検証（HBondAnalyzer）
実装ギャップ: Poisson-Boltzmann+脱溶媒和スコア、SPHGEN互換スフィア生成、GPCR表面アロステリックポケット自動検出が未実装
④ 主な結果 (a) 同時結合による熱安定化 (Tm)
26.0 apo 26.4 NDT 38.8 PMX53 46.9 両方 0 50°C 見かけ融解温度 Tm

apo 26.0°C → 両拮抗薬同時で 46.9°C へ。PMX53とNDT9513727が同時結合し相加的に安定化。

④ 主な結果 (b) 相乗的拮抗 (log IC50向上)
PMX53濃度↑ → NDTのlog IC50 -6.76 0nM -7.14 30nM -7.57 100nM -7.77 300nM 弱 強

PMX53添加でNDTのlog IC50が-6.76→-7.77へ向上。逆もまた然り（PMX53: -7.78→-8.70）。2部位の存在を裏付け。

④ 主な結果 (c) アロステリック作用機序

4つの非ペプチド薬がTM3/4/5アロステリック部位に化学多様なポーズで結合。共通鍵は保存残基W213(5.49)とのH結合。

avacopan
最深部結合・shape相補性最良 → 最高potency。F135/I220/F224と追加接触
CP-447697
W213(5.49)とのH結合が弱い（~3.5 Å）→ potency低
C221(5.57)
遊離Cysが近接 → 共有結合型不可逆拮抗薬の足がかり

→ shape相補性 + W213(5.49)H結合 が設計のcritical factor。

④ 主な結果 (d) 構造的発見
  • 2.2 Å構造(6C1R)で Rwork/Rfree = 19.2%/22.4%、明瞭な電子密度
  • PMX53はI116(3.32)/V286(7.39)の活性化スイッチを拘束しinsurmountable拮抗
  • HDX-MS: PMX53が受容体全体のダイナミクスを抑制。NDT結合TM7(294–300)はEX1動態で多状態
  • helix 8の逆向き配座（残基313–327, 2σ omitマップ）を新発見。arrestin結合を立体阻害しうる
限界: 相乗効果が結合協同性か効力協同性か不明（放射標識薬未使用）。helix 8の活性化時配座も未確定。
⑤ テイクホーム / 分子設計の新知見
  • 2部位の同時攻略：オルソステリック(PMX53)とアロステリック(avacopan)の同時結合が受容体を相加的に安定化（Tm 26.0→46.9°C）し相乗的に拮抗。多剤併用・二価リガンド設計の構造的根拠。
  • W213(5.49)H結合 + shape相補性が非ペプチド拮抗薬potencyを決める2大因子。種選択性・C5L2(G211 5.49)非結合も同残基で説明。
  • covalent戦略：avacopanのフルオロメチルベンゼン環をクロロキノリン等に置換しC221(5.57)と共有結合させる不可逆拮抗薬の提案（HCV NS35Bの先行例に基づく）。
  • 汎用アロステリック部位：GPR40・P2Y1など多数のrhodopsin様GPCRに保存C5.57を持つ類似部位が存在し、汎用的なdruggableサイトの可能性。
DOI: 10.1038/s41594-018-0067-z | Nature Structural & Molecular Biology 25, 472–481 (June 2018) | PDB: 6C1Q (C5aR–PMX53–NDT9513727, 2.9 Å), 6C1R (C5aR–PMX53–avacopan, 2.2 Å) | Docking: UCSF DOCK 3.6 | Category: computational_chemistry