Loop-Driven Stabilization in the HRAS i-motif
Combined all-atom simulations + biophysical assays (Malloum, Arciuolo, Pokorná, ..., Magistrato; J Chem Inf Model 2026)
目標: HRASプロモーターの monomeric i-motif の立体構造を εRMSD-MetaD と多重 5μs MD で解明し、loop が core 安定化を決める発見を CD/NMR/DSC + 変異体で実験確証する。
① 背景と課題

問題設定: HRAS プロモーターの i-motif は癌関連の薬剤標的候補だが、X 線は dimer のみで、生理条件で支配的な monomer の構造が未解明。i-motif は柔軟で従来手法では難しい。

従来手法の限界:

  • NMR/X 線で動的な loop を捉えにくい
  • RMSD ベース MetaD は loop の動きが CV を支配し折り畳みが進まない
  • i-motif の K+ ion 局在は実験単独では特定が難しい
  • 変異体の構造的影響を予測する一般化可能な枠組みが乏しい
② 手法 — εRMSD-MetaD + 多重5μs MD + biophys validation
Workflow: dimer → wt-MetaD fold → 5μs MD → biophys mutants X-ray dimer PDB 8DHC extract chain A 36 wt-MetaD εRMSD CV (core) 5/36 fold OK Plain MD 5 μs × 4 reps GROMACS+PLUMED Barnaba cluster + ion analysis CD/NMR/DSC biophys validate Mutant design (T19/T25) → exp confirm

core cytosine だけを reference にした εRMSD CV を使い loop を unbiased にしたまま wt-MetaD で folding 駆動。代表構造から 5 μs × 4 replica plain MD、Barnaba クラスタリングと cpptraj ion 解析、CD/NMR/DSC で実験確証、T19/T25 変異体で MD 予測検証。

③ 本研究で示したこと
  • iHRAS monomer の 3D 構造を MD で初めて確立
  • loop L1/L3 由来の G6:G19 cap が C5:C18 を選択的に保護する recurrent stabilizer
  • K+ ion が phosphate と guanine 間に局在し loop conformer を決定
  • T19/T25 変異体で melting T1/2 が低下し MD 予測を実証
④(a) wt-MetaD 結果
36 Total replicas 5 Folded iM 4 Stable G:G cap wt-MetaD outcome

36 replicas のうち 5 本が fully folded iM 達成。さらに 4 本で G:G cap が「強制せずに自発形成」、これが本研究の核となる発見。

④(b) iM core 剛性
0.18 run1 0.19 run2 0.21 run3 0.17 run4 iM core RMSD (nm) over 5μs

5 μs 全長で平均 RMSD < 0.2 nm の高剛性。末端の C+:C ペア (C3:C16, C11:C25) のみ動的。

④(c) Loop conformer 占有率
60 L1+L3 cap 18 open-1 12 open-2 10 open-3 Loop conformer occupancy (%)

Barnaba クラスタリング（cutoff 4.8 Å）で L1+L3 cap 状態が累積 60% を占有、残りは base-exposed open 状態。

④(d) 変異体の melting
58 iHRAS (WT) 51 iHRAS-T19 47 iHRAS-T25 CD melting T1/2 (°C, qualitative)

G19→T で cap 消失、G25→T で loop 構造変化。CD/DSC ともに T1/2 が低下し MD 予測を実験で確証。

主要指標と設定の比較
項目設定備考
力場AMBER 系 nucleic acid + TIP3P + 100 mM KClOL21/parmbsc1 系
CVεRMSD（core cytosine のみ reference）Barnaba 実装
wt-MetaDσ=0.1, bias=20, pace=250 steps, upper wall 1.7T=300K, τ=70
plain MD5 μs × 4 + 1 (heterogenize)GROMACS+PLUMED
解析contact number (r0=0.315 nm), Barnaba clustering, cpptraj ion gridCN=2.8 が C+:C 3 H-bond
実験CD, NMR (1H 600 MHz), DSC, native PAGEpH 5.0 acetate buffer
⑤ テイクホームメッセージ
  • i-motif core は剛だが loop が安定化の dial。loop-driven cap が普遍的な i-motif 安定化因子。
  • 核酸の MetaD は core を CV、loop を unbiased という設計が肝。
  • K+ ion 局在が loop conformer を選択し、生体条件での folding に寄与。
  • MD 予測 → 変異設計 → 実験確証 の閉ループは、他の non-canonical 核酸にも展開可能。
本研究のインパクト
  • HRAS i-motif を狙う ligand 設計の構造的基盤を提供
  • εRMSD-MetaD + Barnaba を lib/md/nucleic に統合する強い動機
  • G-quadruplex 等他の non-canonical 核酸への手法横展開の道筋
Malloum A, Arciuolo V, Pokorná P, Grisanti L, Pagano B, Amato J, Magistrato A. J. Chem. Inf. Model. 2026, 66, 3276–3287. DOI: 10.1021/acs.jcim.5c03176