Protein design for cyclic peptide and small molecule binding
マクロ環ペプチドと結合タンパクを両方 de novo 設計する CID システム ｜ PhD 論文 (2026, U. Washington, Baker Lab)
🎯 化学誘導性二量体化(CID)のリガンドと受容体タンパクを最初から計算設計し、新規・直交な CID を構築する（マクロ環で成功、HIV プロテアーゼ阻害剤バインダーは限界を率直に記録）。
① 背景と課題

CID(rapamycin–FKBP–FRB 等)は外部から細胞プロセスを制御する強力な合成生物学ツールだが、天然リガンドは免疫抑制・off-target など問題を抱える。本論文はリガンドもタンパクも de novo 設計すればほぼ無限の直交 CID を作れるという発想で、第1章=設計マクロ環(MC)入力のホモ二量体 CID、第2章=FDA 承認 HIV プロテアーゼ阻害剤入力の単量体バインダーに挑む。

従来の CID 拡張は directed evolution・ファージディスプレイ・既存ドメイン流用が中心
入力リガンドも内在性化合物や蛍光色素など研究用試薬に限られていた
既存ドメイン流用では新規性・直交性に乏しい

→ CID の両側(リガンド+タンパク)を一から設計。閉環で全主鎖アミドを H 結合 or N-メチル化し膜透過性と構造秩序を両立

② 手法: Rosetta マクロ環設計 + DL
Rosetta マクロ環 + RIFdock 5/6/7残基ループ生成 末端βヘアピン H 結合・残りを N-メチル化 幾何ハッシュで閉環 N→C と C→N 変換が一致するループ対(2本の主鎖H結合) ProteinMPNN/AF2 + RIFgen/RIFdock 頑健スキャフォールドへ MC1 配置 FastDesign → AF2 濾過 → 263設計 pLDDT>90, RMSD<1.1 → 17 を実験検証
全主鎖アミド = H結合 or N-メチル化
→ 膜透過性を担保。MC1: apL*F*apL*F* C2対称・8アミド中2 cis

第2章は pseudocycle×CA-RFdiffusion でリガンド内包骨格を直接生成(ドッキング不要)+LigandMPNN+AF3 resampling。Baker 研ツールは公開。

③ 本研究で示したこと（要点）
  • CID の両側（マクロ環リガンド+受容体タンパク）を de novo 設計する統合パイプライン
  • 幾何ハッシュによる閉環マクロ環骨格設計（全アミドを H 結合/N-メチル化で充足し膜透過性を担保）
  • 設計 MC CID を哺乳類細胞で実証（可逆・低毒性）
  • HIV プロテアーゼ阻害剤バインダーは結合ゼロという限界を率直に記録（in-silico 信頼度と実結合の乖離）
④ 主な結果 (a) 結合親和性
36.0 ITC 0.4 mass photometry CID7–MC1 KD (nM, ↓強)

ホモ二量体 CID7 が MC1 を nM 親和で結合（MBP 融合で ~0.4 nM）。

④ 主な結果 (b) 構造精度
0.97 MC1 0.95 タンパク鎖 設計 vs 結晶 Cα-RMSD (Å)

X 線構造は設計どおり C2 対称、設計モデルとほぼ完全一致。

④ 主な結果 (c) 細胞内活性
16× MC1-CID7 17× rapamycin対照 eGFP 誘導 (倍率)

two-hybrid EC50 9.4 µM・NanoBiT 約3倍で可逆。PAMPA Papp 1.1×10⁻⁵ cm/s。

④ 主な結果 (d) 設計ファネル
第1章 設計ファネル AF2 濾過 263 設計 実験検証 17 結合体 CID7 1

第2章(HIV PI)は 6057設計→AF3 resampling でも酵母ディスプレイ結合ゼロ。

⑤ テイクホームメッセージ
🔗 両側 de novo
CID のリガンド（マクロ環）と受容体タンパクを一から設計。
💊 膜透過マクロ環
全主鎖アミドを H 結合/N-メチル化で充足し PAMPA 透過性を確保。
🔬 設計精度
結晶構造が設計と Cα-RMSD ~0.97 Å、細胞内で可逆誘導（EC50 9.4µM）。
⚠️ 率直な限界
HIV プロテアーゼ阻害剤バインダーは結合ゼロ、in-silico 信頼度と実結合の乖離。
2 章の結果
章入力リガンド結果
第1章設計マクロ環 MC1成功: KD 36nM・細胞で可逆誘導
第2章HIV PI (amprenavir 等)結合ゼロ（要改良）
本研究のインパクト
  • lib/molgen: 幾何ハッシュ閉環(MacrocycleBackboneCloser)を実装し、5/6/7 残基ループの 6D 変換をビンにハッシュして閉環マクロ環骨格を列挙。全アミドを H 結合/N-メチル化で充足する制約で膜透過性マクロ環ライブラリを生成
  • lib/docking: RIFgen/RIFdock 流の「リガンド好都合側鎖の interaction field → スキャフォールド空洞へ配置」をフィルタ(interface>900Ų/SC>0.7/ΔΔG<−40/buried unsat<1)とともに UniDockRunner/ProLIFCalculator の設計時スコアラに転用
  • lib/fep: 設計後の AF2/AF3 信頼度(pLDDT/iPTM)が実結合と乖離する教訓から、MMGBSAEngine 等の物理ベース ΔΔG を binder/non-binder 判別の補助フィルタとして併用
Hanna, S. Protein design for cyclic peptide and small molecule binding. PhD Dissertation, University of Washington (Baker Lab). 2026.